Captor reports

Projektowanie ligandów ligazy GID4

W ostatnich latach ligazy E3 znalazły się w centrum zainteresowania badaczy rozwijających nowoczesne strategie terapii celowanych. Wykorzystanie naturalnych mechanizmów degradacji pozwala na selektywne usuwanie białek odpowiedzialnych za rozwój chorób, takich jak nowotwory. Szczególnie obiecujące efekty uzyskano w leczeniu szpiczaka mnogiego, gdzie terapie oparte na degradacji białek wykazały wysoką skuteczność i bezpieczeństwo w badaniach klinicznych. CRBN i VHL stanowią dziś podstawę technologii celowanej degradacji białek (ang. targeted protein degradation, TPD). Aby jednak w pełni wykorzystać potencjał tej strategii terapeutycznej potrzebne są dalsze badania - nie tylko skupione na optymalizacji samych degraderów, ale także rozszerzające poszukiwania nowych ligaz E3, które mogłyby uzupełnić narzędzia TPD. Poszerzenie zestawu dostępnych ligaz rzutować może z kolei na selektywność i skuteczność nowych terapii oraz pomóc przełamać oporność na leczenie, niekiedy występujące przy użyciu ligazy CRBN .

W naszej nowej publikacji pt. Ligand-induced Conformational Plasticity of the CTLH E3 Ligase Receptor GID4 przedstawiamy wyniki badań wskazujące na wysoki potencjał w celowanej degradacji białek znacznie mniej poznanego białka – ligazy GID4. W pracy przedstawiamy rozwój jej ligandów. GID4 wyróżnia się dużą plastycznością strukturalną oraz zdolnością do rozpoznawania szerokiej gamy cząsteczek, co czyni ją szczególnie interesującym celem w projektowaniu nowych leków.

Ligaza GID4 – receptor w kompleksie degradacyjnym

Ligazy E3 to enzymy, które odgrywają kluczową rolę w procesie degradacji białek poprzez przyłączanie ubikwityny do białek przeznaczonych do usunięcia. Białko GID4 jest podjednostką receptorową kompleksu ligazy E3 znanego jako kompleks CTLH. Jego główną rolą jest rozpoznawanie charakterystycznych motywów białkowych, nazywanych degronami. W szczególności ligaza ta wiąże tzw. degrony Pro/N-end, czyli sekwencje białek rozpoczynające się od N-końcowej proliny. Mechanizm ten został po raz pierwszy opisany u drożdży, gdzie odpowiada za kontrolę degradacji enzymów glukoneogenezy. U człowieka funkcje GID4 są jednak znacznie szersze. Białko to uczestniczy między innymi w regulacji metabolizmu lipidów, wpływa na migrację komórek oraz bierze udział w procesach zachodzących w jądrze komórkowym, takich jak splicing RNA czy remodelowanie chromatyny.

Architektura molekularna – baryłka z ukrytą kieszenią

Pod względem strukturalnym GID4 przyjmuje charakterystyczne sfałdowanie typu β-barrel, czyli strukturę przypominającą cylindryczną baryłkę zbudowaną z β kartek. W jej wnętrzu znajduje się głęboka, hydrofobowa kieszeń, która stanowi miejsce wiązania degronów lub syntetycznych ligandów.

Dostęp do kieszeni kontrolują cztery elastyczne pętle strukturalne. Można je porównać do molekularnych “drzwi”, ponieważ w zależności od rodzaju wiążącej się cząsteczki mogą otwierać lub zamykać wejście do wnętrza białka. Szczególnie ważną rolę odgrywają pętle L2 i L3 – ich ruchy w dużym stopniu decydują o kształcie i objętości kieszeni wiążącej.

Nasze badania krystalograficzne pozwoliły wskazać aminokwasy kluczowe dla interakcji z ligandami. Jednym z najważniejszych jest reszta aminokwasowa Glu237, która stabilizuje ligand w kieszeni wiążącej. Mutacja tej reszty całkowicie znosi zdolność wiązania tych cząsteczek. Tak zorganizowana kieszeń umożliwia bardzo precyzyjne rozpoznawanie określonych motywów białkowych, a jednocześnie pozostaje wystarczająco elastyczna, aby dopasować się do nowych ligandów. Zrozumienie tej architektury pozwoliło na dalsze badania nad dynamiką strukturalną GID4.

Dynamika strukturalna – trzy stany konformacyjne jednego białka

Jednym z najważniejszych rezultatów naszej pracy było rozwiązanie aż 49 struktur krystalicznych GID4. Analiza odległości między pętlami pozwoliła wyróżnić trzy główne konformacje białka:

• Forma zamknięta – najczęściej obserwowana w kompleksach z naturalnymi peptydami. Pętle L2 i L3 zbliżają się do siebie, znacząco zmniejszając objętość kieszeni wiążącej.
• Forma półotwarta – stan pośredni, zwykle indukowany przez ligandy zawierające pierścienie aromatyczne.
• Forma otwarta – pętle L2 i L3 są wyraźnie odsunięte od siebie, co znacznie zwiększa objętość kieszeni. Ta konformacja okazała się szczególnie interesująca z punktu widzenia projektowania małych cząsteczek.

Spektakularny wzrost powinowactwa ligandów

Praca nad ligandami GID4 rozpoczęła się od niewielkiego fragmentu chemicznego o stosunkowo słabym powinowactwie wynoszącym około 78 µM. Dzięki strategii projektowania leków opartej na strukturze białka (ang. structure-based drug design) udało się stopniowo zoptymalizować cząsteczkę do poziomu 23–30 nM. Oznacza to ponad 2500-krotny wzrost siły wiązania.

Kluczową cechą ligandów GID4 jest zdolność do wykorzystywania regionów kieszeni białka, które nie są zajmowane przez naturalne substraty. Wprowadzone modyfikacje wyjściowej cząsteczki kierują się w stronę dodatkowych reszt hydrofobowych, zwiększając powierzchnię kontaktu i wzmacniając interakcje pomiędzy ligandem a resztami białka.

Aktywność liganda w systemach biologicznych

Nowe ligandy przetestowano także w układzie komórkowym przy użyciu testu stabilności termicznej. Wyniki pokazały, że cząsteczki nie tylko wiążą białko w warunkach in vitro, ale również przenikają przez błonę komórkową i stabilizują GID4 wewnątrz komórek. Zaobserwowano wzrost temperatury agregacji białka o około 3,6°C, co stanowi silny dowód na skuteczną interakcję ligand–białko w środowisku komórkowym. Efekt działania cząsteczek przekłada się na wyraźną poprawę stabilności białka, co potwierdza skuteczność ligandów w wiązaniu do GID4.

Pierwsze kroki w stronę degraderów białek

Kolejnym etapem było stworzenie cząsteczek typu PROTAC - chimer łączących ligand ligazy E3 z ligandem białka docelowego. W tym przypadku wykorzystany został inhibitor bromodomen JQ1, który wiąże białko BRD4 wybrane jako potencjalny cel degradacji. Chociaż w testach komórkowych cząsteczka typu PROTAC nie prowadziła jeszcze do degradacji BRD4, w eksperymentach biochemicznych udało się wykazać tworzenie kompleksu trójskładnikowego z udziałem GID4 i BRD4 mediowanego przez cząsteczkę typu PROTAC. Jest to ważny dowód koncepcji pokazujący, że GID4 może w przyszłości pełnić rolę rekrutera w systemach TPD.

Co dalej z ligandami GID4?

Przeprowadzone analizy strukturalne wykazały, że otwarta konformacja GID4 ma parametry bardzo zbliżone do ligazy cereblon, która jest obecnie jednym z najlepiej poznanych przykładów białek wykorzystywanych w projektowaniu klejów molekularnych. Kleje molekularne stabilizują bezpośredni kontakt między ligazą E3 a białkiem przeznaczonym do degradacji (tzw. neosubstratem). Aby taki mechanizm był możliwy, ligaza musi posiadać odpowiednią kombinację objętości kieszeni wiążącej oraz powierzchni interakcji białko–białko. Otwarta forma GID4 spełnia te warunki niemal idealnie, co sugeruje, że białko to może stać się atrakcyjnym celem także dla projektowania nowych leków opartych na tym mechanizmie.

Nowa przestrzeń dla celowanej degradacji białek

Znaczenie badań nad GID4 wykracza poza poznanie struktury pojedynczego białka. Opracowanie silnych ligandów dla tej ligazy znacząco rozszerza wiedzę na temat technologii degradacji białek, a w przyszłości może wpływać na skuteczność terapeutyczną TPD w medycynie i dostęp do bezpieczniejszych metod leczenia. Poznawanie potencjału nowych ligaz może przyczyniać się do rozwoju nowych terapii, a wraz z dalszym rozwojem istnieje realna szansa, że w nadchodzących latach GID4 stanie się jednym z elementów nowej generacji leków i terapii celowanych degradujących białka.